GB/T 37363.4-2020 涂料中生物杀伤剂含量的测定 第4部分:多菌灵含量的测定 | 梦能涂料每日解读标准
核心定位： 涂料及涂膜、原材料中多菌灵含量的“专属精准测定标尺”。本标准规定了采用液相色谱法（LC）和液相色谱-质谱/质谱联用法（LC-MS/MS）测定涂料中多菌灵含量的原理、试剂材料、仪器设备、样品处理、试验步骤、数据处理、检出限与精密度等技术要求。两种方法均以甲醇提取并结合超声与离心分离，分别以保留时间或保留时间与选择离子定性、外标法定量，检出限分别为5 mg/kg与1 mg/kg，重复性相对偏差不大于10%、再现性不大于20%。该标准为相关检测提供了可操作且具备较高灵敏度与准确性的方法依据。
一、 标准基本信息
| 项目 | 内容 |
|---|---|
| 标准编号 | GB/T 37363.4-2020 |
| 发布/实施 | 2020-11-19发布 / 2021-10-01实施 |
| ICS | 87.040 G 50 |
| 适用范围 | 涂料中多菌灵含量的测定。涂膜及涂料用原材料中多菌灵含量的测定也可参考本部分。 |
| 核心内容 | 规定了原理、试剂和材料、仪器设备、样品、试验步骤（LC法和LC-MS/MS法）、试验数据处理、检出限、精密度和试验报告。 |
| 归口单位 | 全国涂料和颜料标准化技术委员会(SAC/TC 5)。 |
二、 核心原理（第3章）
3： 液相色谱法:以甲醇为提取溶剂,用超声提取和离心分离相结合的方法提取试样中的多菌灵,用液相色谱仪(LC)检测,以保留时间定性,外标法定量。
液相色谱-质谱/质谱联用法:以甲醇为提取溶剂,用超声提取和离心分离相结合的方法提取试样中的多菌灵。用液相色谱-质谱/质谱联用仪(LC-MS/MS)检测,以保留时间和选择离子定性,外标法定量。
梦能涂料解读： 本标准的原理是超声提取-色谱分析。以甲醇为提取溶剂，通过超声提取和离心分离将涂料中的多菌灵提取出来，再通过LC或LC-MS/MS进行分离和定量。LC法以保留时间定性，LC-MS/MS法以保留时间和选择离子定性，两种方法均采用外标法定量。
三、 核心试剂和材料（第4章）
| 试剂 | 规格/要求 | 梦能涂料工程意义 |
|---|---|---|
| 多菌灵 | 质量分数不小于99%,或已知纯度 | 用于配制标准储备溶液和标准工作溶液。 |
| 甲醇 | 色谱纯 | 提取溶剂和标准溶液稀释溶剂。色谱纯确保无干扰杂质。 |
| 乙酸铵 | 色谱纯 | LC-MS/MS法流动相添加剂，改善峰形和离子化效率。 |
| 微孔滤膜 | 有机相,孔径0.45 μm (LC用);孔径0.22 μm (LC-MS/MS用) | 用于过滤提取液，确保色谱分析时无颗粒堵塞色谱柱。 |
| 不锈钢金属筛 | 孔径 0.55 mm | 用于固态样品的粉碎过筛。 |
| 水 | GB/T 6682-2008,一级 | 用于配制流动相。 |
四、 核心仪器设备（第5章）
| 仪器 | 规格/要求 | 梦能涂料工程意义 |
|---|---|---|
| 高速离心机 | 转速 12 000 r/min 以上,可控温 | 用于分离提取液。温度不超过30℃防止多菌灵降解。 |
| 超声波提取仪 | 功率≥500 W | 用于超声提取试样中的多菌灵。超声提取20 min。 |
| 天平 | 精度 0.1 mg | 用于称取试样和标准物质。 |
| 液相色谱仪 | 配置紫外检测器或者二极管阵列检测器 | LC法核心设备。用于多菌灵的分离和检测。 |
| 液相色谱-质谱/质谱联用仪 | 配置电喷雾离子源 | LC-MS/MS法核心设备。用于多菌灵的分离和检测。 |
| 容量瓶 | 适合的规格,GB/T 12806-2011 A级 | 用于配制标准溶液和样品定容。 |
| 分度吸量管 | 适合的规格,GB/T 12807-1991 A级 | 用于移取标准溶液和样品溶液。 |
| 单标线吸量管 | 适合的规格,GB/T 12808-2015 A级 | 用于移取标准溶液和样品溶液。 |
五、 核心试验步骤（第7章）
7.1 样品前处理
7.1.1 平行试验： 平行做两份试验。
7.1.2 液相色谱法： 将样品搅拌均匀[如样品为固态,可在室温下用粉碎设备将样品粉碎,并用不锈钢金属筛(4.5)过筛],称取约1g试样(精确至0.1mg),于25mL容量瓶(5.6)中,记录试样质量m,加入约10mL甲醇(4.1),充分振摇使试样得到最大程度分散,再用甲醇(4.1)稀释至刻度,充分振摇使试样得到最大程度分散,制成试样溶液,记录定容体积V。用超声波提取仪(5.4)在水浴温度不超过30℃的条件下超声提取20 min后,移取适量上述溶液于离心管中,在离心机腔体温度不超过30℃的条件下离心20 min~30 min,至上层出现清液,记为溶液A。取适量溶液A或溶液B,用微孔滤膜(4.4)过滤,保留滤液C,用于提取溶液的测定(7.6.1)。
7.1.3 液相色谱-质谱/质谱联用法： 将样品搅拌均匀[如样品为固态,可在室温下用粉碎设备将样品粉碎,并用孔径0.55mm不锈钢金属筛(4.5)过筛],称取约0.5g试样(精确至0.1mg),于25mL容量瓶(5.6)中,记录试样质量m,加入约10mL甲醇(4.1),充分振摇使试样得到最大程度分散,再用甲醇(4.1)稀释至刻度,充分振摇使试样得到最大程度分散,制成试样溶液,记录定容体积V。用超声波提取仪(5.4)在水浴温度不超过30℃的条件下超声提取20 min后,移取适量上述溶液于离心管中,在离心机腔体温度不超过30℃的条件下离心20 min~30 min,至上层出现清液,记为溶液D。用单标线吸量管(5.8)移取1mL溶液D于25mL容量瓶(5.6)中,用甲醇(4.1)稀释至刻度,记为溶液E。取适量溶液E,用微孔滤膜(4.4)过滤,保留滤液F,用于提取溶液的测定(7.6.2)。
梦能涂料解读： 样品前处理是试验的关键。LC法称样量约1g，LC-MS/MS法称样量约0.5g。超声提取20 min，离心温度不超过30℃。LC-MS/MS法需将提取液稀释25倍（1 mL→25 mL），以降低基质干扰。
7.4 配制标准工作溶液： 称取约 0.02 g 多菌灵(4.3),精确至 0.1 mg,于 100 mL 容量瓶(5.6)中,用甲醇(4.1)定容至刻度,再采用逐级稀释的方法,用分度吸量管(5.7)或单标线吸量管(5.8)移取上述溶液于适合的容量瓶(5.6)中,用甲醇(4.1)稀释上述溶液成适用质量浓度的多菌灵标准工作溶液。另需配制一个不加多菌灵标样的工作溶液。标准工作溶液在 4 ℃以下避光保存,有效期为 7 d。
7.5 绘制标准工作曲线： 按测试条件测定标准工作溶液,每一种标准工作溶液重复进样两次,峰面积取平均值,其相对偏差应不大于5%。以峰面积为纵坐标(扣除不加标的标准工作溶液中多菌灵的峰面积),相应质量浓度为横坐标,绘制标准工作曲线。标准工作曲线至少包括五个标准工作溶液。液相色谱法标准工作曲线的线性判定系数R2应大于0.999,液相色谱-质谱/质谱联用法标准工作曲线的线性判定系数R2应大于0.995。否则应重新绘制新的标准工作曲线。
7.6 提取溶液的测定
7.6.1 液相色谱法： 按测试条件测定滤液C,以保留时间定性,记录多菌灵的液相色谱图,对多菌灵的峰面积(扣除空白试验中多菌灵的峰面积)定量,通过标准工作曲线得出滤液C中多菌灵的质量浓度ρ。
7.6.2 液相色谱-质谱/质谱联用法： 按测试条件测试滤液F。记录多反应监测(MRM)色谱图,对定量选择离子进行峰面积积分(扣除空白试验中多菌灵的峰面积),采用外标法定量。通过标准工作曲线得出滤液F中多菌灵质量浓度ρ。
梦能涂料解读： 标准工作曲线是定量分析的基础。LC法要求R2 > 0.999，LC-MS/MS法要求R2 > 0.995。每个浓度点进样两次，峰面积相对偏差≤5%。样品测定采用外标法定量，通过保留时间（LC法）或保留时间和选择离子（LC-MS/MS法）定性。
六、 试验数据处理（第8章）
8： 试样中多菌灵的含量以多菌灵的质量分数 w 计,数值以毫克每千克(mg/kg)表示,按公式(1)计算:
式(1)： w = (ρ × V × F) / m
式中：
ρ——从标准工作曲线上读取的多菌灵的质量浓度,单位为微克每毫升(μg/mL);
V——试验溶液的定容体积,单位为毫升(mL);
F——试验溶液的稀释因子;
m——试样的质量,单位为克(g)。
计算两次平行试验测试结果的平均值,以平均值报出结果。当测定值小于100 mg/kg时,结果表示到小数点后一位;当测定值大于或等于100 mg/kg且小于1000 mg/kg时,以整数值报出结果;当测定值大于或等于1000 mg/kg时,以三位有效数字乘以幂次方报出结果。
9 检出限： 液相色谱法:多菌灵的检出限为5 mg/kg。液相色谱-质谱/质谱联用法:多菌灵的检出限为1 mg/kg。
梦能涂料解读： 计算是标准的核心。多菌灵含量计算公式为：w = (ρ × V × F) / m。结果取两次平行试验的平均值。检出限是方法灵敏度的核心指标：LC法为5 mg/kg，LC-MS/MS法为1 mg/kg。
七、 精密度（第10章）
10.1 重复性： 在同一实验室,由同一操作者使用相同设备,按相同的测试方法,并在短时间内对同一被测对象相互独立进行测试获得的两次测试结果的相对偏差不大于10%,以相对偏差大于10%的情况不超过5%为前提。
10.2 再现性： 在不同的实验室，由不同的操作者使用不同的设备，按相同的测试方法，对同一被测对象相互独立进行测试获得的两次独立测试结果的相对偏差不大于20%，以相对偏差大于20%的情况不超过5%为前提。
梦能涂料解读： 精密度要求是确保试验结果可靠性的关键。重复性（同一实验室）相对偏差≤10%，再现性（不同实验室）相对偏差≤20%。在工程应用中，建议建立实验室内部质量控制程序，定期进行重复性验证。
八、 LC参考条件（附录A）
A.1 液相色谱条件
| 参数 | 条件 |
|---|---|
| 色谱柱 | C18 反相色谱柱,4.6 mm × 150 mm, 5 μm |
| 流速 | 0.5 mL/min |
| 柱温 | 35 ℃ |
| 进样量 | 10 μL |
| 流动相 | 甲醇+水(50+50,体积比) |
| 检测器 | 二极管阵列检测器(DAD) |
| 检测波长 | 286 nm |
九、 LC-MS/MS参考条件（附录B）
B.1 液相色谱-质谱/质谱联用条件
| 参数 | 条件 |
|---|---|
| 色谱柱 | C18 反相色谱柱,2.1 mm × 50 mm, 2.7 μm |
| 流速 | 0.3 mL/min |
| 柱温 | 35 ℃ |
| 进样量 | 1 μL |
| 雾化气 | 氮气,纯度≥95% |
| 干燥气温度 | 350 ℃ |
| 干燥气流量 | 9 L/min |
| 雾化气压力 | 344 737.85 Pa(50 psi) |
| 碰撞气 | 高纯氮气,纯度≥99.999% |
| 流动相A | 5 mmol/L的乙酸铵水溶液 |
| 流动相B | 甲醇 |
| 质谱离子源 | 电喷雾离子源(ESI) |
| 离子化方式 | 正离子扫描 |
| 毛细管电压 | +3 000 V |
| 监测方式 | 多反应监测(MRM) |
表B.1 梯度洗脱程序
| 时间/min | 流动相 A/% | 流动相 B/% |
|---|---|---|
| 0 | 30 | 70 |
| 4.00 | 30 | 70 |
| 4.01 | 0 | 100 |
| 8.00 | 0 | 100 |
表B.2 多菌灵的多反应监测条件
| 化合物名称 | 母离子 m/z | 子离子 m/z | 碰撞能量eV | 去簇电压V | 加速电压V |
|---|---|---|---|---|---|
| 多菌灵 | 192 | 160* | 14 | 28 | 3 |
| 多菌灵 | 192 | 132 | 34 | 28 | 3 |
注： * 定量子离子。
十、 关键工程要点（梦能涂料解读）
1. 两种检测方法的选择： 标准提供了LC法和LC-MS/MS法两种检测方法。LC法检出限为5 mg/kg，操作简便、成本较低；LC-MS/MS法检出限为1 mg/kg，灵敏度更高，可提供定性信息。在工程应用中，建议根据检测目的和实验室条件选择合适的方法。
2. 超声提取条件的控制： 超声提取是样品处理的核心步骤。LC法称样量约1g，LC-MS/MS法称样量约0.5g。超声提取20 min，离心温度不超过30℃，防止多菌灵降解。LC-MS/MS法需将提取液稀释25倍（1 mL→25 mL），以降低基质干扰。
3. 标准工作曲线的质量控制： 标准工作曲线至少需配制5个浓度点。LC法要求R2 > 0.999，LC-MS/MS法要求R2 > 0.995。每个浓度点进样两次，峰面积相对偏差≤5%。在工程应用中，建议每次测试前绘制新的标准工作曲线，或定期验证标准曲线的有效性。
4. 检出限的差异： LC法检出限为5 mg/kg，LC-MS/MS法检出限为1 mg/kg。LC-MS/MS法灵敏度更高，适用于低浓度多菌灵的检测。在工程应用中，若多菌灵含量低于检出限，可报告为“未检出（<5 mg/kg）”或“未检出（<1 mg/kg）”。
5. 精密度要求的工程意义： 重复性（同一实验室）相对偏差≤10%，再现性（不同实验室）相对偏差≤20%。在工程应用中，建议建立实验室内部质量控制程序，定期进行重复性验证，确保测试结果的可靠性。
6. 安全警示： 标准警示：“使用本部分的人员应有正规实验室工作的实践经验。本部分并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。”在工程应用中，所有操作需在通风柜和个人防护条件下进行，特别是涉及有机溶剂和生物杀伤剂的操作。
十一、 核心总结
GB/T 37363.4-2020的核心逻辑清晰：通过超声提取（甲醇，20 min，≤30℃）将涂料中的多菌灵溶解到溶液中，通过LC法（C18柱，286 nm检测）或LC-MS/MS法（C18柱，ESI+，MRM模式）实现多菌灵的分离和定量，通过标准工作曲线（5个浓度点，LC法R2 > 0.999，LC-MS/MS法R2 > 0.995）确保定量准确性，通过外标法定量计算多菌灵含量，通过严格的精密度要求（重复性≤10%，再现性≤20%）确保结果可靠性。其中，检出限（LC法5 mg/kg，LC-MS/MS法1 mg/kg）是方法灵敏度的核心指标，LC和LC-MS/MS测试条件（附录A、附录B）是确保分离效果和检测灵敏度的关键。本标准为涂料中多菌灵含量的测定提供了科学、可靠的技术依据，是涂料行业有害物质检测的重要标准。